Что такое Иммуноферментный анализ (ELISA), основные виды и отличия — Bialexa

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Иммуноферментный анализ: виды и основные отличия

Наиболее часто на практике используются три варианта твердофазного иммуноанализа — непрямой иммуноанализ, прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Различия между этими типами иммуноанализа заключаются в следующем. В непрямом варианте иммуноанализа на первой стадии на поверхность лунок полистирольного планшета сорбируется антиген. После удаления несвязавшихся молекул антигена добавляется образец, содержащий специфичные к данному антигену антитела. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело детектируются с помощью анти-видовых антител, конъюгированных с какой-либо меткой (Рис. 1А). В прямом варианте иммунанализа детекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой (Рис. 1Б). В иммуноанализе сэндвич-типа на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой (Рис. 1В). Использование в иммуноанализе сэндвич-типа антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови.

Рис. 1. Принцип непрямого (А), прямого (Б) и иммуноанализа сэндвич-типа (В)

Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA)

Метод непрямого иммуноанализа характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах.

I. Сорбция антигена

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка

Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

III. Раститровка специфичных антител

Раститровку можно проводить как по горизонтальным, так и по вертикальным рядам планшета. Необходимо отметить, что раститровка антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных конкретных антител разведение.

При раститровке в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител — в среднем 1-10 мкг в лунку, далее проводят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфичными антителами проводят в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 3 раза.

IV. Добавление антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой

В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc-фрагментам специфичных антител. Концентрация детекторных антител как правило указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000). Инкубация со вторичными антителами проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ОФД.

Раствор субстрата: К 10 мл субстратного буфера (0,1 М Na-цитратный буфер, рН 4,5) добавить 0,01 мл 30% перекиси водорода и 0,2 мл 50х раствора ОФД (340 мг ОФД в 10 мл этилового спирта; хранить при –20°С).

Инкубация проводится в течение 10 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Читайте также:  Варикоз мошонки причины, симптомы и лечение

V. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М H2SO4. В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

VI. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA)

Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV опускается, а дальнейшие стадии (V-VII) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа.

Иммуноанализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay)

Рис. 2. Схематическое изображение иммуноанализа «сэндвич»-типа. АТп — антитело подложки, АТд — детекторное антитело, АГ — антиген, М — метка, ковалентно связанная с детекторным антителом, П — подложка, на которую сорбируется антитело подложки.

В данном варианте иммуноанализа (Рис.2) используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

I. Сорбция антител подложки

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антитела подложки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0,1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка

Для блокирования мест неспецифичного связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

III. Инкубация с антигеном

В лунки планшета с преадсорбироваными антителами вносят по 50 мкл исследуемого раствора либо стандартных разведений антигена. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе PBST, поскольку Tween-20 снижает неспецифичное связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемый раствор, и стандартные разведения антигена вносят попарно (либо по 3 повторности), используя по две (три) лунки на каждое разведение белка. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется раствором PBST 3 раза.

IV. Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой

В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител как правило указывается производителем (обычно используют концентрацию 2-4 мкг/мл). Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

V. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта

В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

VI. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М H2SO4. В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

VII. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Набор для определения Гепсидина 25, EIA-5258

предлагаем Вам ознакомиться с обновленной информацией о наборе Гепсидин 25, EIA-5258

Антитела к глутаматдекарбоксилазе (Anti-GAD), EIA1910

Плазмин α-2-Антиплазмин Комплекс (PAP Complex), EIA3763

Набор Плазмин альфа-2-Антиплазмин Комплекс (DRG РАР micro ELISA) – иммуноферментный анализ для количественного определения плазмин альфа-2-Антиплазмин Комплекса (PAP) в плазме человека.

Данный набор предназначен только для in vitro диагностики.

Удаление полимеризованного фибрина из сосудистой системы, протеолитическое растворение (фибринолиз) имеет важное значение для поддержания гемостатического равновесия. Ключевым ферментом фибринолитической системы является плазмин. Кроме его фибринолитической функции в плазме, плазмин также играет центральную роль в активации дегенеративных (например, коллагеназы) и воспалительных (например, система комплемента) процессов в тканях.

[quickshop product=»Плазмин α-2-Антиплазмин Комплекс (PAP Complex), EIA3763″]

Ферритин, EIA1872

[quickshop product=»Ферритин, EIA1872″]

Эритропоэтин, EIA3646

Эритропоэтин (ЭПО) – сильно гликозилированный белок с молекулярной массой 30 000 – 34 000 Да. Человеческий ЭПО – это полипептид, состоящий из 165 аминокислот, содержащих одну О-гликозидную цепь и три N-гликозидных цепи углеводов. Рекомбинантный ЭПО – хорошая замена нативному белку для использования в ИФА. Сывороточный уровень ЭПО зависит от степени выработки и степени выведения протеина. 90% ЭПО вырабатывается перитубулярными клетками взрослой почки в ответ на снижение оксигенации тканей. Есть факты, доказывающие, что протеин в этих клетках, который определяет насыщенность крови кислородом, это гем-содержащий компонент. Со снижением pO2 плазмы, как функции гематокрита, концентрация ЭПО повышается. Также есть наблюдения, позволяющие предполагать, что обычно есть обратная корреляция между уровнем ЭПО в сыворотке и эритроцитарной массой.

Читайте также:  Ребенок плачет во время кормления, извивается и выгибает спину, когда сосет грудь почему это происхо

Подсчет количества эритропоэтина в сыворотке служить диагностическим признаком в определении причин анемии или эритроцитоза. Апластическая анемия, гемолитическая анемия, а также железодефицитная анемия все ведут к повышению уровня ЭПО. В то же время уровень ЭПО у пациентов с вторичной анемией из-за почечной недостаточности и других заболеваний, таких как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), обычно необъяснимо низкий для уровня анемии. Это скорее всего вызвано нарушением функции больной почки вырабатывать необходимое кол-во эритропоэтина. Низкие концентрации ЭПО могут предсказать угрозу отторжения пересаженной почки. ЭПО может также использоваться для мониторинга больных СПИДом, принимающих Зидовудин (АЗТ). Повышенная концентрация ЭПО подтверждает, что анемия, связанная с применением АЗТ вызвана гипоплазией эритроцитов или аплазией.

Полицитемия красная (истинная), или первичный эритроцитоз (увеличение эритроцитарной массы), вызывается непростимулированной гиперпродукцией эритроцитов. Отсюда увеличение гемоглобина, вызывающее, как следствие, снижение продукции ЭПО, которое, в свою очередь, вызывает снижение уровня сывороточного ЭПО. Вторичные полицитемии, которые также характеризуются снижением общей эритроцитарной массы, появляются как физиологический ответ на повышенный уровень циркулирующего ЭПО, вызванный тканевой гипоксией. Гипоксия может быть вызвана такими факторами, как фиброз легкого, сердечно-сосудистые заболевания, длительное нахождение на больших высотах, ненормальные формы гемоглобина или лекарственное лечение. Некоторые опухоли вырабатывают ЭПО, и, в этом случае, ЭПО может использоваться как онкомаркер для мониторинга эффективности лечения.

1. Sawyer, S.T., Krantz, S.B., Sawada, K. Receptors for Erythropoietin in Mouse and Human Erythroid Cells and Placenta. Blood 1989; 74: 103-109.
2. Imai, N., Kawamura, A., Higuchi, M., et al. Physicochemical and Biological Comparison of Recombinant Human Erythropoietin with Human Urinary Erythropoietin. J Biochem 1990; 107: 352-359.
3. Jacobson, L.O., Goldwasser, E., Fried, W., Pizak, L.F. The Role of the Kidney in Erythropoiesis. Nature 1957; 179: 633-634.
4. Koury, S.T., Bondurant, M.C., Koury, M.J. Localization of Erythropoietin Synthesizing Cells in Murine Kidney by in-situ Hybridization. Blood 1988; 71: 524-527.
5. Goldberg, M.A., Dunning, S.P., Bunn, H.F. Regulation of the Erythropoietin Gene: Evidence that the Oxygen Sensor is a Heme Protein. Science 1988; 242: 1412—1415.
6. Erslev, A.J., Caro, J., Birgegard, G., Silver, R., Miller, O. The Biogenesis of Erythropoietin. Experimental Hematology 1980; Suppl 8: 1-13.
7. Spivak, J.L. The Mechanism of Action of Erythropoietin. Int J Cell Cloning 1986; 4: 139-166.
8. Erslev, A.J. Erythropoietin. New Eng J Med 1991; 324:1339—1344.
9. Garcia, J.F., Ebbbe, S.N., Hollander, L., Cutting, H.O., Miller, M.E., Cronkits, E.P. Radioimmunoassay of Erythropoietin: Circulating Levels in Normal and Polycythemic Human Beings. J Lab Clin Med 1982; 99: 624-635.
10. Wild, D., editor. The Immunoassay Handbook, Stockton Press, 1994, p. 428.
11. Wide L., Bengtsson C., Birgegard G. Circadian Rhythm of Erythropoietin in Human Serum. Br J Haematol 1989; 72: 85-90.
12. Cahan C., Decker M.J., Arnold J.L., Washington L.H., Veldhuis J.D., Goldwasser E., Strohl K.P. Diurnal Variations in Serum Erythropoietin Levels in Healthy Subjects and Sleep Apnea Patients. J Appl Physiol 1992; 72: 2112-7.
13. Goldwasser E. and Sherwood J.B. Annotation, Radioimmunoassay of Erythropoietin. Br J Haematol 1981; 48: 359-63.
14. Kricka L.J. Human Anti-Animal Antibody Interferences in Immunological Assays. Clin Chem 1999; 45: 942-956.
15. Cotes P.M. and Spivak J.L. Erythropoietin in Health and Disease. Erythropoietin Molecular, Cellular and Clinical Biology, Editors: Erslev A.J., Adamson J.W., Wschbach J.W., Winearls C.G. 1991; Chapter 11:184-207.
16. Jelkmann W. Renal Erythropoietin: Properties and Production. Rev Physiol Biochem Pharmacol 1986; 104: 139-215.
17. Cotes M.P. Anomalies in Circulating Erythropoietin Levels. Annals of NY Acad, Sci 1994; 718:103-9.
18. Wintrobe’s Clinical Hematology, ninth edition, edited by Lee G.R., Bithell T.C., Foerster J., Athens J.W., Lukens J.N. Lea & Febiger, Philadelphia 1993.
19. Fairbanks V. Q & A. CAP Today Nov 1996, pg. 88.
20. Spivak, JL. “Erythrocytosis”, Hematology: Basic Principles and Practice; editors: Hoffman R, Benz EJ Jr., Shattil, SJ; Furie B., Cohen HJ; Silberstein LE; 1995; Chapter 37:484-491
21. Miller, ME, Chandra M, Garcia JF: “Clinical applications of measurement of serum immunreactive levels of erythropoietin”, Ann. N.Y.Acad. Sci. 459: 375-381, 1985.

Читайте также:  Ушиб носа как быстро вылечить опухоль

[quickshop product=»Эритропоэтин, EIA3646″]

Гепсидин-25, EIA5258

Золотой стандарт в измерении гепсидина

Гепсидин — богатый цистеином пептидный гормон, который состоит из 25 аминокислотных остатков. Продуцируется гепсидин в гепатоцитах и играет важную роль в гомеостазе железа. Показано, что гепсидин контролирует уровень железа в плазме за счет регуляции абсорбции железа из кишечника и высвобождения в макрофагах и гепатоцитах. Гепсидин секретируется в ответ на повышение уровня железа и воспаление. При истощении запасов железа выработка гепсидина уменьшается. Увеличение концентрации гепсидина ведет к снижению абсорбции железа. Снижение уровня гепсидина приведет к увеличению высвобождения железа из энтероцитов и макрофагов.

Принцип анализа

Набор ДРГ Гепсидин-25 (биоактивный) ИФА основан на твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) по принципу конкурентного связывания. На микротитровальных лунках иммобилизованы поликлональные антитела против антигенного сайта молекулы гепсидина. Эндогенный гепсидин из образца пациента конкурирует с конъюгатом биотинилированного гепсидина за связывание с иммобилизованными антителами. После инкубации несвязанный конъюгат удаляется с помощью промывки. Связанный биотинилированный гепсидин детектируют по комплексу стрептавидин-пероксидаза хрена. После добавление раствора субстрата интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации гепсидина в образце пациента.

Характеристики анализа

  • Принцип анализа: конкурентное связывание, ИФА.
  • Легкая и прямая процедура анализа (без экстракции и центрифугирования).
  • Все реагенты готовы к использованию.
  • Динамический диапазон: 0.354 — 80 нг/мл гепсидина.
  • Общее время анализа: около 2 часов (60/30/20мин).
  • Объем образца: 20 мкл сыворотки или плазмы (ЭДТА, цитрат, гепарин).
  • Два контроля вложены в набор.
  • Высокая чувствительность.

Назначение

Данный набор предназначен только для in vitro диагностики и профессионального использования.

Гепсидин-25 является основным регулятором всасывание железа из пищи и клеточного выброса железа. Он осуществляет свою регуляторную функцию, противодействуя функции ферропортина, основного экспортера железа в мембране макрофагов, гепатоцитов и базолатеральный поверхности энтероцитов. Гепсидин-25 индуцирует интернализацию и деградацию ферропортина, что приводит в результате к увеличению внутриклеточных запасов железа, снижению всасывания железа и концентрации циркулирующего железа.

Некоторые физиологические и патологические процессы регулируют синтез гепсидина. Ситуации, в которых увеличивается потребность в циркулирующем железе (частично эритропоэтическая активность), вызывают снижение гепатоцеллюлярного синтеза гепсидина. Эти условия включают: дефицит железа, гипоксию, анемию и состояния, характеризующиеся повышенной активностью эритропоэза. Снижение уровня гепсидина ведет к высвобождению накопленного железа и увеличению поглощения железа из пищи. С другой стороны, инфекции и воспаление вызывают увеличение синтеза гепсидина, что в свою очередь приводит к дефициту железа, доступного для эритропоэза и считается, что также приводит к запуску механизма, лежащего в основе ретикулоэндотелиальной секвестрации железа, недостаточности кишечного всасывания железа и низкой концентрации железа в сыворотке крови, характерной для анемии хронических заболеваний.

С момента открытия гепсидина, многочисленные исследования способствовали пониманию регуляции гепсидина и его функциональные характеристики. Потенциальные расстройства, связанные с гепсидином, описываюся ниже.

Дисфункция в цепи гепсидин-ферропортин – главный механизм недостаточного количества железа при таких заболеваниях как наследственный гемохроматоз, талассемия и некоторые заболевания печени. И наоборот, переизбыток гепсидина, как следствие воспаления, приводит к эритропоэзу с ограниченным содержанием железа, проявляющемся как анемия хронического воспаления.

Уровень гепсидина легко определить с помощью набора ДРГ EIA-5258 гепсидин-25 (биоактивный).

ELISA

В лунки 96-ти луночного планшета для проведения иммуноанализа добавьте 100 мкл буферного раствора для иммобилизации, содержащего антитела. Мы рекомендуем использовать конечную концентрацию антител для иммобилизации в диапазоне 5-10 мкг/мл. Проведите инкубацию в течение 2 часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании на горизонтальном шейкере для планшетов, либо в течение ночи при +4℃. Для удаления несвязавшихся антител, промойте 1 раз планшет буферным раствором для промывки (PBST)

Инкубация с антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена

В лунки планшета внесите по 100 мкл раствора специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация большинства конъюгированных антител производства ООО фирмы «Имтек» составляет 0,1 мкг/мл. Проведите инкубацию при комнатной температуре в течение 60 минут при постоянном перемешивании. Для удаления несвязавшихся конъюгированных антител, проведите отмывку планшета раствором PBST 5-6 раза.

Проведение ферментативной реакции

В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора субстрата (ТМБ) и инкубируют в течение 5-10 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании, в защищенном от света месте до появления в лунках синего окрашивания разной интенсивности

Остановка ферментативной реакции

Остановка реакции проводится добавлением в каждую лунку планшета по 50 мкл 0,5М серной кислоты. Окраска стабильна в течение 30 мин

Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при длине волны 450 нм с использованием планшетного спектрофотометра

Ссылка на основную публикацию
Что показывает фекальный кальпротектин, и как сдавать
Эффективность анализа кала на кальпротеин в диагностике кишечных заболеваний Обилие и доступность легкоусвояемой пищи, сидячий образ жизни и повышенная стрессовая...
Что надо принимать от кашля
Чем лечить кашель и как делать это правильно Чем лечить кашель и как делать это правильно Кашель - это рефлекс,...
Что не так с «Эреспалом» и чем его можно заменить
ЭРЕСПАЛ: препарат выбора при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Доказано! В каких исследованиях подтверждена высокая эффективность применения препарата ЭРЕСПАЛ при ОРЗ?...
Что помогает от боли в животе список спазмолитиков и других препаратов
Дротаверин Инструкция по применению: Цены в интернет-аптеках: Дротаверин – синтетический препарат, снижающий тонус гладких мышц внутренних органов и способствующий уменьшению...
Adblock detector