Что такое вирусы и как с ними бороться

Сборка вирионов и выход их из клетки

Синтез компонентов вирусных частиц в клетке разобщен и может протекать в разных структурах ядра и цитоплазмы. Вирусы, репликация которых проходит в ядрах, условно называют ядерными. В основном это ДНК-содержащие вирусы: адено-, папова-, парвовирусы, вирусы герпеса. Вирусы, реплицирующиеся в цитоплазме, называют цитоплазмэтическими. К ним относятся из ДНК-содержащих вирус оспы и большинство РНК-содержащих вирусов, за исключением ортомиксо- и ретровирусов. Однако это разделение весьма относительно, потому что в репродукции тех и других вирусов есть стадии, протекающие соответственно в цитоплазме и ядре.

Внутри ядра и цитоплазмы синтез вирусспецифических молекул также может быть разобщен. Так, например, синтез одних белков осуществляется на свободных полисомах, а других—на полисомах, связанных с мембранами. Вирусные нуклеиновые кислоты синтезируются в ассоциации с клеточными структурами вдали от полисом, которые синтезируют вирусные белки. При таком дизъюнктивном способе репродукции образование вирусной частицы возможно лишь в том случае, если вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью при достаточной концентрации узнавать друг друга в многообразии клеточных белков и нуклеиновых кислот и самопроизвольно соединяться друг с другом, т. е. способны к самосборке.

В основе самосборки лежит специфическое белок-нуклеиновое и белок-белковое узнавание, которое может происходить в результате гидрофобных ионных и водородных связей, а также стерического соответствия. Белок-нуклеиновое узнавание ограничено небольшим участком молекулы нуклеиновой кислоты и определяется уникальными последовательностями нуклеотидов в некодирующей части вирусного генома. С этого узнавания участка генома вирусными капсидными белками начинается процесс сборки вирусной частицы. Присоединение остальных белковых молекул осуществляется за счет специфических белок-белковых взаимодействий или неспецифических белок-нуклеиновых взаимодействий.

Объединение белка с вирусными нуклеиновыми кислотами в клетке происходит спонтанно как чисто физико-химическая реакция агрегации, требующая участия дополнительных факторов (рН, ионной силы, ионов металлов, осмоса и т.п.). После того как концентрация вирусных РНК и белка достигает критического уровня; у сложно устроенных вирусов принципы самосборки обеспечивает от начала до конца морфогенез вирионов.

Для того чтобы представить этап созревания дочерних вирусных частиц у парамиксовирусов, необходимо выяснить, каким образом молекула 50S РНК, около 10 тыс. молекул белков, липидов и сахара собираются в зараженной клетке и образуют морфологически и биологически полноценную частицу. Созревание можно разделить на три этапа: 1) образование внутриклеточных нуклеокапсидов; 2) организация вирусной мембраны; 3) выход зрелой вирусной частицы из клетки с помощью так называемого почкования.

Образование нуклеокапсидов. Быстрое включение 50S РНК в капсид обусловлено сравнительно быстрым и в избытке накоплением в. зараженной клетке структурных белков нуклеокапсидов. Формирование (ассемблирование) вирионов происходит путем самосборки, которая обусловлена «узнаванием» РНК белками. Полагают, что узнающим белком является белок Р, поскольку он наиболее жестко связан с РНК в вирусных частицах. Считают, что узнаваемый участок РНК локализуется на 5′-конце молекулы. Нуклеокапсиды накапливаются в цитоплазме зараженных клеток, причем скорость образования внутриклеточных нуклеокапсидов гораздо выше, чем скорость образования вируса. Образование внутриклеточных нуклеокапсидов сопряжено во времени с биосинтезом 50S РНК.

Организация вирусной мембраны. Структурной основой вирусных и цитоплазматических мембран является двойной липидный слой. Последний у вирусной мембраны почти без изменений повторяет липидный слой плазматической мембраны клетки-хозяина. Мембраны вирусных частиц содержат наружный (гликопротеиды HN и F) и внутренний белковый слой (белок М).

В построении вирусной мембраны участвуют предсуществующие липиды клеточных мембран. Гликопротеиды вируса включаются в мембраны зараженных клеток, поэтому вскоре после их заражения в наружных мембранах клеток выявляется поверхностный вирусный антиген (гликопротеид HN, являющийся одновременно гемагглютинином, нейраминидазой и рецепторным белком).

В плазматических мембранах клеток, зараженных вирусом гриппа, обнаружены все белки липопротеидной оболочки вируса: НА (либо НА1 + НА2); NA (нейраминидаза) и М (внутренний белок вирусной мембраны). Гликопротеиды НА (гемагглютинина) и NA синтезируются в так называемых шероховатых мембранах, т.е. в мембранах, с которыми связаны синтезирующие белки рибосомы. После синтеза полипептиды транспортируются по гладким плазматическим мембранам в комплекс Гольджи, где происходит тримминг углеводных цепей. Из комплекса Гольджи гликопротеиды поступают в наружные мембраны. Происходит сборка структур, состоящих из 6 молекул гемагглютинина, вокруг одной молекулы нейраминидазы. Белок М синтезируется там же, где и гликопротеиды, но транспортируется иначе и накапливается на внутреннем листке плазмалеммы.

Читайте также:  Промежуточный мозг (диэнцефальный)

Гемагглютинин вируса гриппа синтезируется в зараженной клетке в виде предшественника, который в процессе транспорта в плазматические мембраны нарезается на две неравные субъединицы: большую и малую. Нарезание осуществляется клеточными протеазами. Степень нарезания зависит от штамма вируса и клеточной системы. При нарезании предшественника возрастает инфекционность вируса. Последняя снижена у частиц, содержащих молекулы гемагглютинина, часть которых ИЛИ все они не нарезаны. Видимо, нарезание гемагглютинина существенно для адсорбции и для стадии проникновения вируса. Обработка вирионов гриппа трипсином увеличивает эффективность адсорбции и его проникновения. Отсутствие нарезания гемагглютинина приводит к нарушению способности вирусного потомства заражать новые дочерние клетки. Нуклеокапсиды парамиксовирусов способны узнавать модифицированные М-белком участки наружных мембран зараженных клеток. Нуклеокапсиды связываются непосредственно с этими модифицированными участками. Вслед за этим начинается процесс выпячивания всего конгломерата, заканчивающийся отторжением. Этот процесс получил название «почкование». Липидосодержащие вирусы животных почкуются на плазматических мембранах клеток и содержат элементы оболочек клетки-хозяина. По сути, вирусная оболочка представляет собой модифицированную вирусными белками клеточную мембрану.

Главная роль в организации липопротеидной мембраны вируса, равно как и во включении нуклеокапсида в участок почкования, видимо, принадлежит белку М.

В связи с разнообразием структуры вирусов животных разнообразны и способы формирования вирионов, однако можно сформулировать следующие общие принципы сборки

1) у просто устроенных вирусов формируются провирионы, которые затем в результате модификаций белков превращаются в вирионы. У сложно устроенных вирусов сборка осуществляется многоступенчато — сначала формируются нуклеокапсиды или сердцевины, с которыми взаимодействуют белки наружных оболочек;

2) сборка сложно устроенных вирусов (за исключением сборки вирусов оспы и реовирусов) осуществляется на клеточных мембранах. Сборка ядерных вирусов происходит с участием ядерных мембран, сборка цитоплазматических вирусов — с участием мембран эндоплазматической сети или плазматической мембраны, куда независимо друг от друга прибывают все компоненты вирусной частицы; 3) у ряда сложно устроенных вирусов существуют специальные гидрофобные белки, выполняющие функции посредников между сформированными нуклеокапсидами и вирусными гликопротеидами. Такими белками являются матриксные белки у ряда минус-нитевых вирусов (ортомиксо-, парамиксо-, рабдовирусов);

4) сборка нуклеокапсидов, сердцевин, провирионов и вири-онов происходит не во внутриклеточной жидкости, а в специальных структурах, предсуществующих в клетке или индуцированных вирусом («фабриках»);

5) сложно устроенные вирусы для построения своих частиц используют ряд элементов клетки-хозяина, например липиды, некоторые ферменты, у ДНК-геномного SV40 — гистоны, у оболочечных РНК-геномных вирусов — актин, а в составе арена-вирусов обнаружены даже рибосомы. Клеточные молекулы несут определенные функции в вирусной частице, однако включение их в вирион может явиться и следствием случайной контаминации, как, например, включение ряда ферментов клеточных оболочек или клеточных нуклеиновых кислот.

Сборка ДНК-содержащих вирусов. В сборке ДНК-содержащих вирусов есть некоторые отличия от сборки РНК-содержащих вирусов. Как и у РНК-содержащих вирусов, сборка ДНК-содержащих вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм, отличающихся от зрелых вирионов по составу полипептидов. Первый этап сборки заключается в ассоциации ДНК с внутренними белками и формировании сердцевин или нуклеокапсидов. При этом ДНК соединяется с предварительно сформированными «пустыми» капси-дами.

В результате связывания ДНК с капсидами появляется новый класс промежуточных форм, которые называются неполными формами. Помимо неполных форм с разным содержанием ДНК, существует другая промежуточная форма в морфогенезе — незрелые вирионы, отличающиеся от зрелых тем, что содержат ненарезанные предшественники полипептидов. Таким образом, морфогенез вирусов тесно связан с модификацией (процессингом) белков.

Читайте также:  Инвалидность при бронхиальной астме группы и оформление

Сборка ядерных вирусов начинается в ядре, обычно — в ассоциации с ядерной мембраной. Формирующиеся в ядре Промежуточные формы вируса герпеса почкуются в перинукле-арное пространство через внутреннюю ядерную мембрану, и вирус приобретает таким путем оболочку, которая является дериватом ядерной мембраны. Дальнейшая достройка и созревание вирионов происходят в мембранах эндоплазм этической сети и в аппарате Гольджи, откуда вирус в составе цитоплазматических везикул транспортируется на клеточную поверхность.

У непочкующихся липидосодержащих вирусов (вирусов оспы) сборка вирионов происходит в уже описанных цитоплазматических «фабриках», Липидная оболочка вирусов в «фабриках» формируется из клеточных липидов путем автономной самосборки, поэтому липидный состав оболочек значительно отличается от состава липидов в клеточных мембранах

Выход вирусных частиц из клетки

Существует два способа выхода вирусного потомства из клетки: путем взрыва и путем почкования. Выход из клетки путем взрыва связан с деструкцией клетки, нарушением ее целостности, в результате чего находящиеся внутри клетки зрелые вирусные частицы оказываются в окружающей среде. Такой способ выхода из клетки присущ вирусам, не содержащим липопротеидной оболочки (пикорна-, рео-, парво-, папова-, аденовирусы). Однако некоторые из этих вирусов могут транспортироваться на клеточную поверхность до гибели клетки.

Выход из клетки путем почкования присущ вирусам, содержащим липопротеидную мембрану, которая является дериватом клеточных мембран. При этом способе клетка может длительное время сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство, пока не произойдет полное истощение ее ресурсов.

Конструирование лентивирусов

Лентивирусные векторы являются высокоэффективным средством для доставки чужеродной ДНК в различные типы клеток и находят широкое применение в молекулярно-биологических и биомедицинских исследованиях in vitro и in vivo.

Для создания целевых конструкций используется самоинактивирующийся вектор третьего поколения на основе дефектного вируса иммунодефицита человека, в котором удалено около 80% нуклеотидной последовательности генома HIV-1. Вектор кодирует только переносимую ДНК, и содержит cis-элементы, необходимые для ее упаковки и интеграции.

Преимущества лентивирусных векторов:

Любая нуклеотидная последовательность по выбору заказчика.

Последовательность ДНК для конструирования лентивируса может быть синтезирована или клонирована из предоставленного заказчиком материала (плазмидный вектор, РНК, образец тканей).

СЕРВИСКАТ.#ОПИСАНИЕЦЕНА, РУБ.СРОК ВЫПОЛНЕНИЯ
* Цена и сроки выполнения услуги зависят от длины целевой последовательности, необходимости дополнительных работ по клонированию этой последовательности из биологического материала или ее синтеза. Воспользуйтесь формой для расчета цены сервиса on-line для уточнения цены и формирования заказа.
Конструирование лентивирусов Конструирование лентивирусного вектора, кодирующего указанную заказчиком последовательность ДНК под контролем универсального промотора.
Наработка лентивирусных частиц с титром в клетках 293Т в культуральной среде DMEM.
зависит от комплектации заказа* зависит от комплектации заказа*

Сборка лентивирусных частиц происходит в результате коэкспрессии в 293Т клетках хелперных плазмид, кодирующих оболочку вируса везикулярного стоматита и структурные белки вирусных частиц, и генома лентивирусного вектора. Через 2 дня культуральную жидкость, содержащую частицы ленти-вектора, собирают, фильтруют, и определяют титр частиц. Титр частиц, содержащих ген флюоресцентного белка, определяется на трансдуцированных клетках HEK293, титр прочих частиц — по концентрации вирусного капсидного белка р24 в иммуноферментном анализе.

Результат работы (передается Заказчику):

1. ДНК сконструированного лентивирусного вектора, в количестве не менее 3 мкг
2. 10 мл готовых к работе лентивирусных частиц с 10 5 -10 6 TU/мл в среде DMEM
3. Карта вектора и отчет о результатах работы и проверки титра.

Правила безопасности при работе с лентивирусными векторами

В настоящее время векторы третьего поколения являются наиболее безопасной лентивирусной системой. Хотя лентивирусные векторы не способны к саморепликации и инфекционному циклу, широкий тропизм оболочки VSV-g может привести к ненаправленному переносу трансгена при непосредственном контакте с частицами. Поэтому при манипуляциях с лентивирусными векторами необходимо придерживаться правил работы с патогенами третьей-четвертой групп безопасности. Технология самоинактивации обеспечивает, что после интеграции в геном клетки-мишени вирусный геном не способен к репликации, поэтому вероятность возникновения репликационно-компетентного вируса (RCV) в культуре трансдуцированных клеток ничтожно мала. Проверка безопасности культур трансдуцированных клеток проводится с помощью анализов на белок р24.

Вниманию заказчика

В случае невозможности исполнения заказа, возникшей по вине заказчика (например, неверно предоставленной информации о нуклеотидной последовательности, присланных некачественных биологических материалах), произведенные услуги подлежат оплате в полном объеме.

Работа с патогенными организмами

Компания Евроген не принимает биологические материалы, которые могут представлять угрозу инфицирования человека, животных или растений. В случае, если биологический материал, не являясь опасным, получен из или связан с патогенными организмами, организация, где работает Заказчик, должна подтвердить, что указанный материал не является инфекционным и предназначен для научно-исследовательских целей.

Конфиденциальность

Евроген сохраняет за собой неэксклюзивное право использовать полученные в процессе выполнения заказа материалы в коммерческих целях, если подобное использование не нарушает права на интеллектуальную собственность заказчика. Евроген гарантирует сохранение конфиденциальности данных, полученных в процессе выполнения и обсуждения заказа.

Сборка вирусных частиц

Репликационный цикл и точки приложения антиретровирусных агентов. Сборка и созревание – часть VI

Набор белковых «заготовок» ВИЧ и вирусная РНК транспортируются к мембране клетки, где происходит сборка вируса. Полипротеины, предшественники вирусных белков, самостоятельно опосредуют связывание с мембраной клетки и концентрацию всех вирусных компонентов в сферическое образование, которое является незрелым вирусом.

Электронная микроскопия флуоресцентно меченных белков Gag на плазматической мембране. Цветовая гамма инвертирована от оригинальной. Gross L.P Reconfirming the Traditional Model of HIV Particle Assembly. LoS Biol. 2006 Dec;4(12):e445.

На определенном этапе созревания вирус «в черновой отделке» покидает клетку, прихватывая с собой часть ее мембраны и белков клетки так, как если бы квартира из нового дома отправилась в самостоятельное путешествие с внешней стеной дома. Но данная частица еще не готова, и процесс созревания продолжается.

Этапы сборки и созревания. Адаптировано по Mailler E, Bernacchi S, Marquet R. и др.The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 2016 Sep 10;8(9). pii: E248.

В процессе сборки и созревания вируса белковые «заготовки» разрезаются на готовые вирусные белки. Например, полипротеин gp160 расщепляется в аппарате Гольджи клетки на белки gp41 и gp120 при помощи клеточного фермента фурина, а вот для подготовки из полипротеинов Gag (p55) и Gag-Pol (p160) целевых белков требуется вирусный фермент протеаза ВИЧ, та, что наряду с обратной транскриптазой и интегразой, в готовом виде присутствует в зрелом вирусе. Протеаза, «разрезая» на девяти участках «заготовки» полипротеинов Gag (p55) и Gag-Pol (p160), формирует группу зрелых белков, необходимых для сборки полноценного инфицирующего вируса.

Схема незрелого (слева) и зрелого (справа) вириона, а также соответствующие фото криоэлектронной микроскопии. Адаптировано по Sundquist WI, Kräusslich HG. HIV-1 assembly, budding, and maturation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012 Jul;2(7):a006924.

Ингибиторы протеазы препятствуют разделению полипротеиновых комплексов Gag и Gag-Pol протеазой ВИЧ на функциональные вирусные ферменты: протеазу, интегразу и обратную транскриптазу. Без данных ферментов вирусная частица не сможет эффективно инфицировать клетку. В классе представлены следующие препараты: атазанавир , дарунавир , фосампренавир , Калетра (лопинавир/ритонавир), саквинавир , типрановир и экспериментальный TMC-310911 .

Ингибиторы созревания блокируют разделение протеазой ВИЧ длинной белковой цепи, которая кодируется вирусным геном Gag, и содержит ряд протеинов суперкапсида и капсида вируса (матриксный белок p17, капсидный белок p24 и другие). Данные белки играют важную роль в процессе формирования зрелого вируса, а блокировка обработки этих белков приводит к выходу вируса, не способного инфицировать клетки. В классе изучались две молекулы: GSK3532795 и MPC-4326 , исследования прекращены в обоих случаях.

Так выделены в тексте вышедшие на рынок тех или иных стран препараты, синим выделены препараты, которые находятся в различных стадиях клинических испытаний, и таким цветом обозначены препараты, разработка и исследование которых прекращены.

Ссылка на основную публикацию
Что показывает фекальный кальпротектин, и как сдавать
Эффективность анализа кала на кальпротеин в диагностике кишечных заболеваний Обилие и доступность легкоусвояемой пищи, сидячий образ жизни и повышенная стрессовая...
Что надо принимать от кашля
Чем лечить кашель и как делать это правильно Чем лечить кашель и как делать это правильно Кашель - это рефлекс,...
Что не так с «Эреспалом» и чем его можно заменить
ЭРЕСПАЛ: препарат выбора при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Доказано! В каких исследованиях подтверждена высокая эффективность применения препарата ЭРЕСПАЛ при ОРЗ?...
Что помогает от боли в животе список спазмолитиков и других препаратов
Дротаверин Инструкция по применению: Цены в интернет-аптеках: Дротаверин – синтетический препарат, снижающий тонус гладких мышц внутренних органов и способствующий уменьшению...
Adblock detector